BUNSEN本生：ELISA實驗雙抗夾心法的原理和操作步驟

　　BUNSEN本生：ELISA實驗雙抗夾心法的原理和操作步驟
 

　　ELISA實驗的原理

　　包被：抗原或者抗體能以物理性吸附于固相載體表面，原因是蛋白質和聚苯乙x表面間的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反應等免疫活性。

　　標記：抗原或者抗體可通過共價鍵與酶連接成酶結合物而此種酶結合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特點。

　　顯色：酶結合物與相應包被在固相載體的抗原或抗體結合后，也被固定在固相載體上，加入酶的底物之后可出現顯色反應，根據反應的顏色深淺可計算抗原或者抗體的相對含量。

　　雙抗夾心法的操作步驟

　　1.標準品的稀釋與加樣：

　　在酶標包被板上設標準品孔10孔，在、第二孔中分別加標準品100μl，然后在、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻;

　　然后從孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻;

　　然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻;

　　混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為24μg/L  ，16μg/L， 8μg/L，4μg/L， 2μg/L)。

　　2.加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　3.溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　4.配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)

　　5.洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30后棄去，如此重復5次，拍干。

　　6.加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　7.溫育：操作同3。

　　8.洗滌：操作同5。

　　9.顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘。

　　10.終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉色)。

　　11.測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

　　本生教您如何選擇ELISA試劑盒

　　特異性：ELISA試劑盒的特異性于試劑盒的關鍵組分，抗體對有關，若抗體對中之一為多抗，另一個必須為單抗，建議使用雙單抗。

　　靈敏度：靈敏度反映的是試劑盒檢出被檢物質的量的能力，用戶可根據自己樣本中待檢指標的量選擇合適的試劑盒，如果待檢指標量很低，一般的試劑盒不能滿足要求，可選擇高敏的ELISA試劑盒。

　　重復性：科學實驗講求重復性，一般ELISA試劑盒，期板內和板間變異系數應該控制在15%以內。

　　簡便性：試劑盒在高質量數據的情況下，實驗時間越短，操作越便利，越容易受到用戶歡迎。

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